參考周期：常規(guī)試驗(yàn)7-15工作日,，加急試驗(yàn)5個(gè)工作日。

注意：因業(yè)務(wù)調(diào)整,暫不接受個(gè)人委托測試,望諒解(高校,、研究所等性質(zhì)的個(gè)人除外)。

一,、Real time PCR實(shí)驗(yàn) 注意事項(xiàng)：

　　1. 實(shí)驗(yàn)材料的處理和準(zhǔn)備

　　在第一講 RNA 抽提中已經(jīng)講過一些,，還需要注意的是， 以最基本的基因表達(dá)差異分析為例,，實(shí)驗(yàn)材料分為對(duì)照組(CON)和處理組(TRT),。組內(nèi)要有復(fù)孔，要有生物重復(fù),，這樣可以統(tǒng)計(jì)分析此處理是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。

　　2. 引物設(shè)計(jì)

　　一般Real-Time PCR 引物的設(shè)計(jì)遵循下面一些原則：

　　擴(kuò)增產(chǎn)物長度在 80-150bp。

　　引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性,。

　　產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),。

　　產(chǎn)物長度一般在 15-30 堿基之間。

　　G+C 含量在 40%-60%之間,。

　　堿基要隨機(jī)分布,。

　　引物自身不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。

　　引物之間不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ),。

　　引物 5’端可以修飾,。

　　引物 3’端不可修飾。

　　引物 3’端要避開密碼子的第 3 位.

　　Taqman 探針的設(shè)計(jì)稍有不同，遵循以下原則：

　　盡量靠在上游引物;

　　長度 30-45bp,，Tm 比引物高至少 5℃;

　　5’端不要是 G,，G 會(huì)有淬滅作用，影響定

　　3. 常用的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析方法有：

　　雙標(biāo)曲線法,、ΔCt 法,、2‐ΔΔCt法(Livak法 )、用參照基因的ΔCt 法,。

　　雙標(biāo)曲線法：每次實(shí)驗(yàn)都分別用標(biāo)準(zhǔn)品做內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,， 并同時(shí)擴(kuò)增各待測樣本中的目的基因和內(nèi)參基因。然后使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算待測樣本中的目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量,。最后使用如下公式得出目的基因表達(dá)差異,。

　　ΔCt 法：不用內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單,，數(shù)據(jù)分析處理簡單,。 需要準(zhǔn)確量化初始材料(如細(xì)胞數(shù)目或核酸微克數(shù))，擴(kuò)增效率為 100%,。計(jì)算公式如下：

　　2‐ΔCt=2‐(實(shí)驗(yàn)組 Ct‐對(duì)照組 Ct)

　　2‐ΔΔCt法：這是最常用的進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析的方法,，得到的結(jié)果是實(shí)驗(yàn)組中目的基因相對(duì)于對(duì)照組中目的基因表達(dá)的差異倍數(shù)。要求目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都接近 100%,，且相對(duì)偏差不超過 5%,。計(jì)算公式如下：

　　首先用內(nèi)參基因的 Ct 值對(duì)實(shí)驗(yàn)組(test)和對(duì)照組 (con)的靶基因 Ct 值進(jìn)行歸一化：

　　ΔCt test=實(shí)驗(yàn)組目的基因 Ct 值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因 Ct 值

　　ΔCt con=實(shí)驗(yàn)組目的基因 Ct 值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因 Ct 值

　　隨后用對(duì)照組的Ct值歸一實(shí)驗(yàn)組的ΔCt：

　　ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

　　最后計(jì)算表達(dá)水平的差異倍數(shù)：

　　Change Fold=2‐ΔΔCt

　　用參照基因的ΔCt 法：這個(gè)方法的使用前提與2‐ΔΔCt法相同。計(jì)算方法如下：

　　對(duì)照組表達(dá)=2(對(duì)照組內(nèi)參 Ct‐對(duì)照組目的基因 Ct)

　　實(shí)驗(yàn)組表達(dá)=2(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參 Ct‐實(shí)驗(yàn)組目的基因 Ct)

　　這種方法得到的對(duì)照組表達(dá)水平不是 1.0,，但如果將得到的兩個(gè)表達(dá)值都除以對(duì)照組表達(dá)值,，則得到：

　　對(duì)照組 Ratio=1

　　實(shí)驗(yàn)組 Ratio

　　=2(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參 Ct‐實(shí)驗(yàn)組目的基因 Ct)/ 2(對(duì)照組內(nèi)參 Ct‐對(duì)照組目的基因 Ct)

　　=2‐[(實(shí)驗(yàn)組目的基因 Ct‐實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因 Ct)‐ (對(duì)照組目的基因 Ct‐對(duì)照組內(nèi)參基因 Ct)]

　　=2‐(ΔCt test‐ΔCt con)

　　=2‐ΔΔCt

　　得到的比值與2‐ΔΔCt法是相同的，因此用參照基因的ΔCt 法是2‐ΔΔCt的一種變化形式,。

PCR,、western blot、ELISA的取舍?

　　PCR：檢測的是mRNA,，在一些特定情況下mRNA變化不等同于蛋白變化,，如蛋白降解等。此外,，某些mRNA是一定可以翻譯成蛋白的,，如miRNA、lncRNA,、circRNA等,，這種情況只能選擇PCR檢測RNA。此外,，一些通路蛋白,，如p65,、β-catenin等，有較多轉(zhuǎn)錄后修飾方式,，如磷酸化,，這種發(fā)生于蛋白層面的變化PCR也是無能為力的。

　　推薦應(yīng)用：臨床組織,、動(dòng)物組織標(biāo)本的mRNA,、lncRNA、circRNA,、miRNA檢測,。

　　western blot：檢測蛋白表達(dá)或轉(zhuǎn)錄后修飾(磷酸化、剪切體,、甲基化,、蘇素化、泛素化,、乙?；⒍嗑垠w,、降解等),，與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合可以達(dá)到多種目的。應(yīng)用最為廣泛,。細(xì)胞和組織都可以應(yīng)用,，也可以通過提取不同亞細(xì)胞組成用于檢測蛋白的定位情況。為半定量實(shí)驗(yàn),。

　　推薦應(yīng)用：細(xì)胞或組織中通路蛋白,、一般蛋白的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄后修飾。

　　ELISA：為定量實(shí)驗(yàn),，主要用于分泌型蛋白的檢測居多。也可以用于動(dòng)物血清,、組織,、細(xì)胞上清的蛋白檢測。但是不適用于蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的檢測,，不推薦通路相關(guān)蛋白的檢測,。

　　推薦應(yīng)用：細(xì)胞上清、組織,、動(dòng)物血清中分泌型蛋白,，如細(xì)胞因子的檢測。

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